實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳常用於(yu) 分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物，以瓊脂凝膠作為(wei) 支持物，利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA 分子在高於(yu) 其等電點的溶液中帶負電，在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下，忽略DNA分子攜帶的電荷，DNA 分子的遷移速度取決(jue) 於(yu) 分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與(yu) 相對分子量成反比。
不同構型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環形 DNA 分子樣品，其中有三種構型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為(wei) :cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩(liang) 種介質。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子；聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，並通過交聯劑 N,N′-亞(ya) 甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝膠對於(yu) 小片段（5bp-500bp）的分離效果很好，且分辯力*。選擇不同濃度的凝膠，可以分離丌同大小範圍的 DNA 分子。電場強度愈大，帶電顆粒的運動赹快。但凝膠的有效分離範圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，不超過 6V/cm。而對於(yu) 大片段電泳，可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。如果選擇高電壓電泳，可使用聚丙烯酰胺凝膠。
核酸電泳常采用 TAE、TBE、TPE 三種緩衝(chong) 係統。TAE 價(jia) 格低廉，但緩衝(chong) 能力低。TPE 在進行 DNA 回收時，會(hui) 使 DNA 汙染磷酸鹽，影響後續反應。所以綜合考慮，多采用 TBE 緩衝(chong) 液。
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 複合物時，通過發光指示核酸的位置。由於(yu) EB有較強的揮發性和毒性，現在大多選擇EB替代品進行試驗，比較常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整體(ti) 效果都若於(yu) 傳(chuan) 統的EB。
材料、試劑及器具
1、材料
合適的Marker（分子量標準）；DNA 樣品
2、試劑
加樣緩衝(chong) 液（6x或10x）；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）。
3、器具
（1）電泳係統：電泳儀(yi) 、水平電泳槽、製膠板等。
（2）凝膠成像係統或紫外透射儀(yi) 。
實驗過程
1、按所分離的 DNA 分子的大小範圍，選擇合適的比例的凝膠，稱取適量的瓊脂粉，放到一錐形瓶中，加入適量的 TBE電泳緩衝(chong) 液。然後置微波爐加熱至瓊脂粉*溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。待膠液卻至 60℃左右，在膠液內(nei) 加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nei) 緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠麵。
3、待膠凝固後，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內(nei) 。
4、在槽內(nei) 加入TBE電泳緩衝(chong) 液，至液麵覆蓋過膠麵。
5、把待檢樣品，按合適比例與(yu) 加樣緩衝(chong) 液混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀(yi) 和電泳槽，並接通電源，調節合適電壓，穩壓輸出，開始電泳。
7、觀察溴酚蘭(lan) 的帶（藍色）的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時，可停止電泳。
8、在紫外透視儀(yi) 的樣品台上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然後把凝膠放在上麵。關(guan) 上樣品室外門，打開紫外燈（360nm 或 254nm），通過觀察孔進行觀察。
注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為(wei) 中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染於(yu) 衣物、
皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均隻能在專(zhuan) 門電泳區域操作，戴一次性手套，並及時更換。
2、預先加入EB 時可能使 DNA 的運動速度下降15%左右，且不同構型的 DNA 的影響程度不同。所以為(wei) 取得較真實的電泳結果可以在電泳結束後再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝膠放置一段時間後才觀察，即使原來膠內(nei) 或樣品已加 EB，建議選擇EB溶液浸泡染色。
3、加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時**，否則，需重新製膠。
4、電泳時溴酚蘭(lan) 在瓊脂糖凝膠中的運動速度可以用於(yu) 參考電泳速度，已實際電泳條帶運動速度為(wei) 準。
常見問題分析

常見問題	原因	對策
DNA條帶模糊	DNA降解	實驗過程避免核酸酶汙染
	電泳緩衝(chong) 液陳舊	電泳緩衝(chong) 液多次使用後，離子強度降低，PH值上升，緩衝(chong) 能力減弱，從(cong) 而影響電泳效果。TBE建議使用10次就更換緩衝(chong) 液
	所用電泳條件不合適	電泳時電壓不應超過6V/CM，溫度＜30℃，巨大DNA鏈電泳，溫度應＜15℃，核查所用電泳緩衝(chong) 液的緩衝(chong) 能力，注意經常更換
	DNA上樣量過多	減少凝膠中DNA上樣量
	DNA含鹽過高	電泳前通過乙醇沉澱去除多餘(yu) 鹽分
	有蛋白汙染	電泳前酚抽提去除蛋白
	DNA變性	電泳前勿加熱，用TE緩衝(chong) 液稀釋DNA
出現片狀拖帶或塗抹帶	PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往PCR體(ti) 係需要優(you) 化，PCR程序需要摸索。	其對策有：調整PCR體(ti) 係和PCR程序，摸索出合適的條件。
不規則DNA帶遷移	電泳條件不合適	電泳時電壓不應超過6V/CM，溫度＜30℃，巨大DNA鏈電泳，溫度應＜15℃，核查所用電泳緩衝(chong) 液的緩衝(chong) 能力，注意經常更換
不規則DNA帶遷移	DNA變性	電泳前勿加熱，用TE緩衝(chong) 液稀釋DNA
帶弱或無DNA帶	DNA上樣量不夠	增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當降低
	DNA降解	實驗過程避免核酸酶汙染
	DNA跑出凝膠	縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度
	EB染色的DNA，所用光源不合適	應用短波長（254nm）的紫外光源
DNA帶缺失	DNA跑出凝膠	縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度
	分子大小相近的DNA帶不易分辨	增加電泳時間，核準正確凝膠濃度
	DNA變性	電泳前勿加熱，用20mM Nacl 緩衝(chong) 液稀釋DNA
	DNA鏈巨大，常規凝膠電泳不合適	在脈衝(chong) 凝膠電泳上分析
電泳時Ladder扭曲	配膠的緩衝(chong) 液和電泳緩衝(chong) 液不是同時配置	同時配置，電泳緩衝(chong) 液高出液麵1-2mm即可
電泳時Ladder扭曲	電泳時電壓過高	電泳時電壓不應超過6V/CM

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