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實驗原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中經常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內(nei) 部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與(yu) SDS結合而帶負電荷，電泳時在電場作用下，肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由於(yu) 在遷移時受到的阻力不同，在遷移過程中逐漸分開，其相對遷移率與(yu) 分子量的對數間成線形關(guan) 係。
pGLO是將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖啟動子之後的一種表達載體(ti) 。攜帶有pGLO的大腸杆菌在含有相應誘導物和素的條件下培養(yang) ，可以表達GFP，這比不加誘導物的同樣的大腸杆菌在SDS—PAGE凝膠上要多出一條明顯的條帶。表達的蛋白也可用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，紫光燈下可以看到誘導後的樣品在凝膠上有綠色熒光條帶出現。還可以通過**印跡染色（Western—blotting）的方法，用GFP的抗體(ti) 檢測表達的外源蛋白。
[儀(yi) 器、材料和試劑]
(一)儀(yi) 器
1．垂直板電泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．電泳儀(yi)
3．幹式恒溫培養(yang) 器
4．微波爐
(二)材料
1． pGLO表達質粒轉化的大腸杆菌的培養(yang) 物：用阿拉伯糖誘導的和沒有加阿拉伯糖誘導的
(三)試劑
1．1.5mo1／L Tris-HCl pH 8.8 (已加SDS )
2．0.5mo1／L Tris-HCl pH 6.8 (已加SDS)
3．10％SDS
4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放。
5．10％Ap (-20℃存放)
6．2x樣品緩衝(chong) 液
0.5mo1／L Tris-HCl pH6.8 2mL
甘油 2mL
20％SDS 2mL
0.1％溴酚藍 0.5mL
2—?—巰基乙醇 l.0mL
雙蒸水 2.5mL
7．5x電極緩衝(chong) 液
Tris 7.5g
G1y 36 g
SDS 2.5g
雙蒸水溶解，定容至500mL，使用時稀釋5倍使用
8．染色液：0.2g考馬斯亮藍R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，過濾備用。
9．脫色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85
[實驗步驟]
1．裝配做膠用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的膠。選擇兩(liang) 側(ce) 的玻璃夾條為(wei) 1mm的玻璃板，將其夾條麵朝上平放在桌麵上，把灰色的U形矽膠夾條在上麵擺好，然後把帶兩(liang) 個(ge) “耳朵”的凹玻璃放在上麵，使U形矽膠夾條平整、服帖地夾在兩(liang) 塊玻璃板之間。小心地把這玻璃板“三明治”放到“提籃架子”上，用塑料的“楔子”夾緊，注意底部的U形矽膠夾條在夾緊的過程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夾縫加滿蒸餾水，檢驗是否漏，如果漏水必須重裝。
2．配製濃度為(wei) 12％的分離膠 (凝膠濃度應根據被分離蛋白的分子量進行選擇)，配方如下：
雙蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
10％ SDS 100 μL
TEMED 10 μL
10％AP 100 μL
總體(ti) 積 10 mL （剛好灌製兩(liang) 塊膠）
混勻後加入兩(liang) 玻璃夾縫中，並小心在膠麵上加入1cm蒸餾水(在膠麵上加蒸餾水稱水封，目的是保持膠麵平整，並防止膠與(yu) 空氣接觸，影響膠的聚合)，室溫放置，等膠自然凝聚後（此時在膠麵與(yu) 水封之間可見清晰的界限），將水封傾(qing) 去。這時可以開始配製4％的濃縮膠，配方如下：
雙蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris-HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
10％ SDS 30 μL
TEMED 5μL
10％Ap 30μL
總體(ti) 積 3.0 mL （夠做兩(liang) 塊板的濃縮膠）
混勻後加入到"三明治"玻璃板的夾縫中，然後在把1mm的梳子**濃縮膠中，注意在梳子和濃縮膠之間不要留有氣泡。如果發現有較大的氣泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指彈氣泡處的玻璃等），否則會(hui) 影響電泳結果。待濃縮膠凝固後，小心拔出梳子。如果發現拔出梳子後形成的加樣孔之間的間隔發生扭曲，用注射器的針頭小心加以整理，使之齊整。
3．培養(yang) 物SDS-PAGE樣品的製作：同時做L-阿拉伯糖誘導的和未加L-阿拉伯糖的兩(liang) 個(ge) 大腸杆菌樣。取培養(yang) 物1.5mL加到1.5mL小離心管中，12000r/m離心3分鍾，去上清。在離心沉澱中加約等體(ti) 積的蒸餾水，用槍頭小心地吹打，使充分懸浮，直到沒有明顯的小團塊，然後加入等體(ti) 積的2×樣品緩衝(chong) 液，在100℃沸水浴(或幹式培養(yang) 器)中保溫5min。此時如用槍頭吸取樣品，會(hui) 發現非常粘稠，呈鼻涕狀，這是因為(wei) 有樣品中含有大量DNA的結果。要用胰島素注射器將樣品從(cong) 極細的針頭中打出，反複多次才能將DNA分子打斷，使樣品變得不再粘稠為(wei) 止。將樣品14000r/m離心5分鍾，使不溶物沉澱下來，小心吸取上清加樣。電泳樣品的處理直接關(guan) 係到電泳結果的好壞，一定要認真做樣，否則跑不出好膠來。
4．瓊脂封底：做好膠後，把玻璃板“三明治”從(cong) 架子中取出，將兩(liang) 玻璃板之間的矽膠夾條去掉。去掉夾條後在凝膠的底部會(hui) 留下一空隙，此空隙要用2%融化的瓊脂填滿，否則在玻璃板浸到電極緩衝(chong) 液後空隙中的空氣將很難*排除掉，電泳時會(hui) 明顯影響導電，嚴(yan) 重時會(hui) 使整個(ge) 電泳失敗。瓊脂封底時注意不要產(chan) 生氣泡。
5．電泳槽組裝：封底後將玻璃板“三明治”凹玻璃麵向內(nei) 重新裝到“提籃架子”上，固定好後，將整個(ge) 部件放到電泳槽的外殼中，然後加電極緩衝(chong) 液。加液時要使內(nei) 外槽中的液麵基本等高，內(nei) 槽液的液麵要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保證能夠導電，且電場均勻。
6．加樣：按事先設計好的順序與(yu) 加樣量依次加樣。在樣品的濃度未知的情況下，同一樣品可加一梯度，即每一泳道的加樣量依次減半。這樣，在做第二次電泳時可以其作為(wei) 參考，正確加樣。蛋白分子量標準可以加在靠中間的加樣孔中，也可加在離邊的第2道處（靠邊的一道樣品往往會(hui) 明顯跑斜）。
7．電泳：將電泳槽的蓋子蓋上，把電泳槽的兩(liang) 個(ge) 電極接到電泳儀(yi) 上（注意電極不要接錯），然後接通電源。先將電壓調到80V，當樣品進入分離膠時，調節電壓使恒定在150V。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，關(guan) 掉電源，停止電泳。將玻璃板從(cong) 電泳槽中取出，小心地用舊的電話卡撬開兩(liang) 玻璃板，暴露出膠麵。將濃縮膠部分去掉不要，分離膠放到塑料盒中染色。
8．染色和脫色：凝膠在考馬斯亮藍染色液中染色20分鍾（搖床上緩慢振蕩），然後傾(qing) 去染色液（染色液回收，可反複用數十次），用自來水洗幾下，去掉凝膠上和塑料盒中的染色殘液，加脫色液脫色（搖床上緩慢振蕩），1小時後換一次脫色液，振蕩脫色過夜。*脫色後的凝膠蛋白條帶清晰，背景透明幹淨。這時可以將凝膠拍照或用掃描儀(yi) 進行掃描，作為(wei) 記錄。
