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出現非特異性擴增帶
PCR擴增後出現的條帶與(yu) 預計的大小不致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與(yu) 非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：是引物與(yu) 靶序列不*互補、 或引物聚合形成聚體(ti) 。是Mg2+離子濃度過、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關(guan) 。其次是酶的質和量，往往些來源的酶易出現非特異條帶而另來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會(hui) 出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提退火溫度或采用溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與(yu) 延伸)。
出現片狀拖帶或塗抹帶
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於(yu) 酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過，Mg2+濃度過，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。
克隆PCR產(chan) 物1)克隆PCR產(chan) 物的條件是什麽(me) ？
摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值範圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體(ti) 會(hui) 自連，產(chan) 生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為(wei) 提連接效率，需4℃過夜。
2)PCR產(chan) 物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產(chan) 物隻有條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的聚體(ti) 。少量的引物聚體(ti) 的摩爾數也很，這會(hui) 產(chan) 生比例的帶有引物聚體(ti) 的克隆，而非目的插入片段。為(wei) 此需在克隆前做凝膠純化。
3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什麽(me) 對照實驗？
A）塗布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或汙染上帶有氨苄抗型的質粒，或產(chan) 生氨苄抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用於(yu) 100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul後，用100ul鋪板。培養(yang) 過夜，產(chan) 生1000個(ge) 菌落。轉化率為(wei) ： 產(chan) 生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體(ti) 而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u後含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為(wei) ：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chan) 物，產(chan) 生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體(ti) 失去T。可能是連接酶汙染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶汙染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體(ti) ，連接pGEM-T正對照，轉化頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟，可得100個(ge) 菌落，其中60%應為(wei) 白斑，如產(chan) 生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。
4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什麽(me) 問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為(wei) 提效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有汙染，使3`-T缺失，或抑製連接，抑製轉化。為(wei) 此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新製備。如產(chan) 生大量的藍斑，插入片段汙染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體(ti) 3`-T缺失。
C）插入片段不適於(yu) 連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會(hui) 產(chan) 生嘧啶聚體(ti) ，不利於(yu) 連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修複功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chan) 物末端無A，後者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體(ti) 克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體(ti) 技術資料（TM042）。
E）度重複序列可能會(hui) 不穩定，在擴增中產(chan) 生缺失和重排，如發現插入片段頻率地產(chan) 生缺失和重排，需用重組缺陷大腸杆菌菌株，如SURE細胞
