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隨著分子生物學的發展，越來越多的科研人員熟練掌握了分子生物學的各種試驗技術，並研製成套試劑盒，使基因克隆表達變得越來越容易。但分子生物學的上遊工作往往並非是zui終目的，分子克隆與(yu) 表達的關(guan) 鍵是要拿到純的表達產(chan) 物，以研究其生物學作用，或者大量生產(chan) 出可用於(yu) 疾病治療的生物製品。相對與(yu) 上遊工作來說，分子克隆的下遊工作顯得更難，蛋白純化工作非常複雜，除了要保證純度外，蛋白產(chan) 品還必須保持其生物學活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chan) 生相同數量和質量的蛋白，重複性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純蛋白的方法去純化蛋白。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規模生產(chan) 應用中失敗，因為(wei) 後者要求規模化，且在每日的應用中要有很好的重複性。本文綜述了蛋白質純化的基本原則和各種蛋白純化技術的原理、優(you) 點及局限性，以期對蛋白純化的方法選擇及整體(ti) 方案的製定提供一定的指導。
1 蛋白純化的一般原則
蛋白純化要利用不同蛋白間內(nei) 在的相似性與(yu) 差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的汙染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從(cong) 其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會(hui) 有差異，利用這些差異可將蛋白從(cong) 混合物如大腸杆菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為(wei) 粗分離階段和精細純化階段二個(ge) 階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由於(yu) 此時樣本體(ti) 積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.並可以迅速將蛋白與(yu) 汙染物分開，防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與(yu) 那些大小及理化性質接近的蛋白區分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨純化的*步，它可以初步粗提蛋白質，去除非蛋白成分。蛋白質在硫酸銨沉澱中較穩定，可以短期在這種狀態下保存中間產(chan) 物，當前蛋白質純化多采用這種辦法進行粗分離翻。在規模化生產(chan) 上硫酸銨沉澱方法仍存在一些問題，硫酸銨對不鏽鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉澱出來，PEG是一種惰性物質，同硫酸銨一樣對蛋白有穩定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉澱可通過離心或過濾獲得，蛋白可在這種狀態下長期保存而不損壞。 蛋白沉澱對蛋白純化來說並不是多麽(me) 好的方法，因為(wei) 它隻能達到幾倍的純化效果，而我們(men) 在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從(cong) 混雜有蛋白酶和其他有害雜質的培養(yang) 基及細胞裂解物中解脫出來。
2 緩衝(chong) 液的更換
雖然更換緩衝(chong) 液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩衝(chong) 液。假如你用硫酸銨將蛋白沉澱出來，毫無疑問蛋白是處在高鹽環境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過勤換透析液體(ti) 去除鹽分，此法尚可，但需幾個(ge) 小時，通常要過夜，也難以用予大規模純化中。新型的設備將透析膜夾在兩(liang) 個(ge) 板中間，板的一側(ce) 加緩衝(chong) 液，另一側(ce) 加需脫鹽的蛋白溶液，並在蛋白溶液一側(ce) 通過泵加壓，可以使兩(liang) 側(ce) 溶液在數小時內(nei) 達到平衡，若增加對蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過透析膜進入透析液達到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nei) 的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進入孔內(nei) ，先於(yu) 高濃度鹽離子從(cong) 柱中流出，從(cong) 而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(hui) 造成目的蛋白的丟(diu) 失，緩衝(chong) 液平衡的步驟尤甚。蛋白會(hui) 結合在任何它能接觸的表麵上，剪切力、起泡沫和離子強度的快速變化很容易讓蛋白失活。
3 離子交換色譜
這是在所有的蛋白純化與(yu) 濃縮方法中zui有效方法。基於(yu) 蛋白與(yu) 離子交換樹脂間的相互電荷作用，通過選擇不同的緩衝(chong) 液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結合帶負電荷的分子)結合，也可以和陽離子交換樹脂結合。樹脂所用的帶電基團有四種：二乙基氨基乙基用於(yu) 弱的陰離子交換樹脂;羧甲基用於(yu) 弱的陽離子交換樹脂;季銨用於(yu) 強陰離子交換樹脂;甲基磺酸酯用於(yu) 強陽離子交換樹脂。蛋白質由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環境中所帶總電荷不同。大多數蛋白在生理pH(pH 6—8)下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，的pH下蛋白會(hui) 變性失活.應盡量避免。由於(yu) 在某個(ge) 特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數不同，與(yu) 樹脂的結合力也不同，隨著緩衝(chong) 液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結合力的強弱被依次洗脫 。在工業(ye) 化生產(chan) 中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因為(wei) 前者更容易控製 。在實驗室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩衝(chong) 液中鹽濃度平穩地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從(cong) 柱上洗脫下來。但在工業(ye) 生產(chan) 中鹽濃度很難控製，所以常用分步洗脫而不足連續升高的鹽梯度。與(yu) 排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數可以調整以獲得*的純化效果，樹脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用zui控製的條件，僅(jin) 用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。
4 親(qin) 和層析
親(qin) 和層析基於(yu) 目的蛋白與(yu) 固相化的配基特異結合而滯留，其他雜蛋白會(hui) 流過柱子。本方法存在的問題是：單抗非常昂貴，而且也需先純化;單抗與(yu) 目的蛋白結合力太強.要用苛刻的條件來洗脫，這會(hui) 使目的蛋白失活並破壞單抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體(ti) 或與(yu) 它們(men) 非特異結合;某些單抗也會(hui) 在純化過程中從(cong) 樹脂上解離下來混入產(chan) 物中，也需要從(cong) 終產(chan) 物中去除。親(qin) 和柱通常在純化過程的後期應用，此時標本體(ti) 積已縮小，大部分的雜質已經去除。穀胱甘肽S一轉移酶(Glutathione S—transferase，GST)是
zui常用的親(qin) 和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋白可用交聯穀胱甘肽的層析介質純化，但本方法有以下缺點：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與(yu) 穀胱甘肽結合的空間結構才能用此方法純化;其次，GST標簽多達220個(ge) 氨基酸，如此大的標簽可能會(hui) 影響表達蛋白的可溶性，使形成包涵體(ti) ，這會(hui) 破壞蛋白的天然結構，難於(yu) 進行結構分析，有時即便純化後再酶切去除GST標簽也不一定能解決(jue) 問題。另一種可應用的親(qin) 和純化標簽是6組氨酸標簽，組氨酸的咪唑側(ce) 鏈可親(qin) 和結合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與(yu) 鎳柱結合，在低pH下用咪唑競爭(zheng) 洗脫。組氨酸標簽與(yu) GST相比有許多優(you) 點，首先，由於(yu) 隻有6個(ge) 氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結合力;另外6組氨酸標簽無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動物，也不影響免疫學分析 。雖然有這麽(me) 多的優(you) 點，但此標簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體(ti) 、難以溶解、穩定性差及錯誤折疊等。鎳柱純化時金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(hui) 通過氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(ce) 鏈，而且柱子也會(hui) 非特異吸附蛋白質，影響純化效果。若目的蛋白可與(yu) 某種碳水化合物特異結合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化製成親(qin) 和柱，結合後目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。
5 疏水作用層析
疏水作用層析蛋白是由疏水性和親(qin) 水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位於(yu) 蛋白空間結構的中心部位，遠離表麵的水分子。親(qin) 水性氨基酸殘基則位於(yu) 蛋白表麵。由於(yu) 親(qin) 水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(ge) 蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會(hui) 暴露在外。在高鹽濃度的環境中蛋白的疏水性區域則會(hui) 暴露並與(yu) 疏水性介質表麵的疏水性配基結合。不同的蛋白疏水性不同，與(yu) 疏水作用力大小也不同，通過逐漸降低緩衝(chong) 液中鹽濃度衝(chong) 洗柱子，在鹽濃度很低時，蛋白恢複自然狀態，疏水作用力減弱被洗脫出來。 疏水性樹脂的選擇性是由疏水性配基的結構決(jue) 定的，常用的直鏈配體(ti) 為(wei) 烷基配體(ti) (alkyl ligands)和芳基配體(ti) (arylligands)，鏈越長結合蛋白的能力也越強。理想樹脂種類的選擇應根據目的蛋白的化學性質而定，不能選擇結合力太強的樹脂，結合力太強的樹脂會(hui) 很難洗脫，所以開始時應選用中等結合力的苯基樹脂探討條件。為(wei) 了使選擇合適的介質更容易，Amersham Biosesciences推出了疏水作用樹脂選擇試劑盒，裏麵包括5種不同的樹脂供比較。疏水層析很適合作為(wei) 離子交換純化的下一個(ge) 步驟，因為(wei) 疏水作用層析在高鹽濃度下上樣，從(cong) 離子交換得到的產(chan) 物不需更換緩衝(chong) 液即可使用。蛋白又在低鹽緩衝(chong) 液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩衝(chong) 液的步驟，既節約了時間，又減少了蛋白的丟(diu) 失。
6 排阻層析
也叫凝膠過濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體(ti) 量叫流動相，也稱無效體(ti) 積。太大的蛋白不能進入顆粒的孔內(nei) ，隻能存在於(yu) 無效體(ti) 積的溶液中，將會(hui) zui早從(cong) 柱中洗脫出來，對這部分蛋白無純化效果。由於(yu) 各種蛋白的分子大小不同，擴散進入特定大小孔徑顆粒內(nei) 的能力也各異。大的蛋白分子會(hui) 被先洗脫出來，分子越小，洗脫出來的越晚。為(wei) 得到*的純化效果，應將孔徑大小選在目的蛋白能在無效體(ti) 積和總柱床體(ti) 積的中點附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(you) 點，首先所能純化的蛋白分子量範圍寬，Tosoh Biosesep公司的聚合物樹脂，排阻極限可達20o000kD;其次，樹脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質，純化過程中也不需要能引起蛋白變性的有機溶劑。應該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過濾純化，因為(wei) 本技術所用樹脂有輕度的親(qin) 水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上麵。排阻層析從(cong) 不用於(yu) 純化過程的早期，因為(wei) 這種方法要求標本高度濃縮，上樣量隻能在柱體(ti) 積的1%--4%之間，柱子要細而長才能得到好的分離效果，樹脂本身也比較昂貴，規模化的工業(ye) 生產(chan) 中不太適用。
7 電泳
丙烯酰胺凝膠電泳通常用來查看蛋白混合物樣品的複雜程度和監測純化效果。這種方法分離效果*，可惜很難在不喪(sang) 失精度情況下放大到製備規模，因為(wei) 隨著膠厚度的增加，電泳時的熱效應會(hui) 嚴(yan) 重幹擾蛋白的泳動。在基礎研究中，有時僅(jin) 需要少量的純蛋白進行研究，如蛋白質測序等，此時電泳純化不失為(wei) 一種簡便快速的好方法。丙烯酰胺凝膠電泳也是蛋白純化過程中重要的分析工具，可以檢測目的蛋白是在哪個(ge) 梯度的離子交換柱鹽洗脫液中;可用來判定近年來隨著各學科的迅猛發展，對蛋白純化技術的需求不斷增長，已有的純化方法被日益改進，新型的純化方法也相繼湧現。羥磷灰石是磷酸鈣的結晶，由於(yu) 其理化性質不夠穩定，結合能力差，很難用於(yu) 層析。
